1.內(nèi)毒素專用超濾膜 脂多糖結(jié)構(gòu)的內(nèi)毒素在水溶液中團聚成膠團狀締合物,在膜分離過程中,膠團與膜接觸時會影響其存在形式,其外緣親水鏈如果與膜的親合力很強,團聚分子會因糖鏈與膜之間過強的親合力而分散,改變了團聚狀態(tài),因此,一般超濾膜截留的是在膜表面分散的單分子。 本項目發(fā)明的關鍵在于,調(diào)節(jié)膜材質(zhì),減小超濾膜對膠團外緣糖鏈的親和力,使內(nèi)毒素在膜表面仍呈團聚態(tài),從而實現(xiàn)對團聚大分子的截留。膜材質(zhì)及膜孔徑的優(yōu)選,使大孔徑膜在實現(xiàn)去除熱原的同時,不會對一般中藥成分(如人參皂苷類成分等)造成明顯影響。 內(nèi)毒素專用超濾膜孔徑為5-20萬分子量,試驗中測得內(nèi)毒素去除率達90%以上,對中藥成分(如三七或人參成分)無明顯影響,;待測藥液(內(nèi)毒素濃度5-5000EU/ml),超濾后(可二級超濾)內(nèi)毒素濃度在安全限度之內(nèi) 2.內(nèi)毒素在線監(jiān)測儀 實驗中偶然發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素的粒徑分布與內(nèi)毒素濃度具有相關性,高濃度內(nèi)毒素的粒徑分布主要在200~500 nm之間;低濃度內(nèi)毒素的粒徑主要分布于10~20 nm和200~500 nm之間,因此本項目從內(nèi)毒素存在的膠粒光學特征中獲得啟發(fā),依據(jù)激光散射技術,研制符合注射劑生產(chǎn)中的內(nèi)毒素檢測的專屬儀器,此儀器應以控制注射劑生產(chǎn)中內(nèi)毒素污染為目標,其特征為在線、快速、高靈敏,且價格低廉,實現(xiàn)生產(chǎn)線中的內(nèi)毒素在線監(jiān)控。
2.1 新型內(nèi)毒素檢測儀的研制 2.1.1針對細菌內(nèi)毒素團聚后的光學特征,使用高性能硬件,優(yōu)化光路和散射光接收器,提高內(nèi)毒素檢測靈敏度,并匹配適于內(nèi)毒素粒徑分布的計算分析軟件。進一步對檢測器結(jié)構(gòu)進行改造粒徑檢測儀酒精檢測儀,適宜于在線檢測,并設計預警軟件,對生產(chǎn)線中實時取樣的樣品液中的細菌內(nèi)毒素采用檢測曲線控制,設定安全范圍,從而實現(xiàn)在線檢測、預警一體化的細菌內(nèi)毒素檢測儀器。 2.1.2內(nèi)毒素檢測儀裝置結(jié)構(gòu) 此新型的內(nèi)毒素在線檢測的內(nèi)部構(gòu)造包括:光源、光束處理單元、在線檢測池、散射光接收器及相應的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換處理系統(tǒng)。 光源采用波長632.8nm的He-Ne激光器雙光束,只選擇顆粒真正產(chǎn)生的單散射信號部分,去除干擾信號,激光源在降低對樣品熱效應的同時,加大功率,并針對樣品,選擇合適的發(fā)射功率和波長,自動調(diào)節(jié)激光衰減; 對散射光接受器為光電二極管(APD)檢測器,多角度多點接收,暗基數(shù)小,靈敏度高粒徑檢測儀,速度快,性能穩(wěn)定,通過光電二極管將散射光信號接收并轉(zhuǎn)換成電信號,并配有相應的電信號放大器。 數(shù)據(jù)處理器是對光強轉(zhuǎn)化的電信號,經(jīng)自相關運算得到相關曲線,再由相應的軟件分析出平移擴散系數(shù),最后經(jīng)stoken-Einstein公式,計算出粒徑分布。
2.1.3檢測池在線性改造 目前粒徑檢測儀中所采用的檢測池,均是針對樣品離線檢測而設計的,此檢測池通過外加樣品,將樣品池放于檢測器中進行檢測,無法避免環(huán)境中微粒對檢測結(jié)果的影響;在對不同樣品測試時,還需要通過清洗粒徑檢測儀,更換藥液,容易引起待檢測樣品之間的交叉污染,此檢測池無法滿足注射劑的在線檢測的要求. 經(jīng)過本項目組的試驗考察,根據(jù)注射劑生產(chǎn)線特點,研制出適于注射劑生產(chǎn)線中在線檢測的樣品檢測池,采用類似流動比色池的方法,與檢測樣品溶液直接連接,實現(xiàn)注射劑生產(chǎn)的在線監(jiān)控.此檢測池可以實線與生產(chǎn)線的同步連接、監(jiān)控,根據(jù)注射劑品種設置采樣點間隔,關閉進液口和出液口,使待檢測溶液呈現(xiàn)靜止狀態(tài),對注射劑內(nèi)毒素污染狀況進行監(jiān)控. 2.1.4在線預警軟件 根據(jù)內(nèi)毒素粒徑分布峰強度、粒徑分布范圍與內(nèi)毒素濃度的相關性。分別檢測不同細菌內(nèi)毒素濃度粒徑分布圖,并制作各濃度標準圖譜,在對注射劑進行生產(chǎn)線在線監(jiān)控時,對實時監(jiān)控的粒徑分布圖與內(nèi)毒素超標圖譜進行相似度計算,當相似度大于0.9時,觸發(fā)預警開關. 對注射劑生產(chǎn)過程監(jiān)控時,當細菌內(nèi)毒素濃度超過注射液限度值時,粒徑分布峰會發(fā)生明顯變化,同時相似度曲線發(fā)生大幅波動,觸發(fā)預警系統(tǒng),從而關閉生產(chǎn)管路,及時發(fā)現(xiàn)污染,最大程度的保證已生產(chǎn)出成品的安全性,減少企業(yè)的經(jīng)濟損失。
2.1.5內(nèi)毒素檢測儀樣機 本項目組研制出的內(nèi)毒素檢測儀是世界首臺基于內(nèi)毒素在溶液中存在狀態(tài),能實現(xiàn)在線檢測的內(nèi)毒素檢測儀。測試過程在電腦控制下全自動完成,自動選擇最佳測試參數(shù)(如通道數(shù)、延時時間等),工作穩(wěn)定可靠,操作方便 ,測試速度快,每測一個樣品只需2~5分鐘甲醇報警器,可多次全自動連續(xù)測試,達到最佳的測試精度和重復性。 ①技術性能:在3min內(nèi)可以完成樣品取樣、檢測、結(jié)果輸出,并通過預警曲線反映制劑中細菌內(nèi)毒素的水平,其檢測最低限達到0.25EU/ml,在注射用水(0.5EU/ml)及制劑的安全范圍之內(nèi)。 ②技術參數(shù):儀器檢測指標:1、粒子檢測范圍:1-1000nm 2、波長準確度:誤差≤0.1° 3、細菌內(nèi)毒素檢測限:≤0. 25EU/ml 4、細菌內(nèi)毒素濃度范圍:0. 5-100EU/ml 5、重現(xiàn)性:重現(xiàn)性的典型誤差均小于1% 6、樣品檢測周期:1-3分鐘。 7、準確度:小于國際標準ISO13321允許誤差范圍; 8、儀器檢測類型:固定比色池與連續(xù)檢測的流動檢測池在線監(jiān)控指標:1、在線檢測結(jié)果與離線檢測結(jié)果的差異性低于5% 2、檢測池流速可調(diào),樣品異常在6分種內(nèi)完成報警 3、檢測池體積:0.5-5ml 4、預警限度范圍:與內(nèi)毒素超標圖譜相似度大于0.9或內(nèi)毒素含量變化超過50%,自動預警軟件 5、連續(xù)檢測頻度:次/5-10分鐘,具體由實際生產(chǎn)條件確定。 ③技術水平:此儀器對細菌內(nèi)毒的檢測充分考慮了注射劑特別是中藥注射劑的生產(chǎn)特點,這在國內(nèi)外將是首次以檢測細菌內(nèi)毒素的粒徑分布特征,檢測周期低于3min,已經(jīng)研制出的內(nèi)毒素檢測儀靈敏度達到目前注射用水內(nèi)毒素含量限度指標(0.5EU/ml),超過制劑內(nèi)毒素含量限度指標(1-10EU/ml)
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